1、飼料中粗蛋白的測定

 

1、飼料中粗蛋白的測定

飼料中粗蛋白的測定一般采用GB/T6432-2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》。

(1)樣品的粉碎粒度：要求粉碎后全部通過0.42 mm標(biāo)準(zhǔn)篩。樣品粒度會對分析時間和測量效果產(chǎn)生影響，需要根據(jù)不同的樣品物理性質(zhì)及蛋白質(zhì)含量對樣品進行粉碎過篩[3)。

(2)合適的稱樣量：根據(jù)待測樣品中粗蛋白含量的高低，預(yù)估鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用量，保證滴定體積在10mL以上，一般魚粉、肉粉、羽毛粉、玉米蛋白粉類飼料原料稱樣量為0.25 g左右，豆粕、棉粕、濃縮飼料稱樣量為0.40 g 左右，配合飼料稱樣量為 0.50g左右，玉米、次粉類樣品稱樣量為0.80g左右，一般樣品加入6.4g混合催化劑和12 mL 硫酸即可，稱樣量大的樣品在消解時可適當(dāng)補加3~5 mL 硫酸。研究表明，消化過程中催化劑的性質(zhì)和用量對終結(jié)果有顯影響[4]。

(3)消解溫度和時間一般控制在420℃、4h左右。當(dāng)消解液為澄清的藍綠色時，代表消解完全:如消解液為渾濁狀，則消解不完全，可能的原因有消解溫度偏低、消解時間不夠等，需提高消解溫度或延長消解時間。

(4)消解過程控制：為防止爆沸導(dǎo)致消化液沾壁、消解不徹底，消解溫度應(yīng)逐漸升高:若樣品水分含量較高，直接消解會發(fā)生暴沸，可以選擇程序升溫，180C維持30min270C維持30min420°C維持2~3 h。

(5)高脂肪或高糖類樣品在消解時應(yīng)注意防止產(chǎn)生大量泡沫，該類樣品稱完樣后可在消解液中浸泡2h后再進行消解。

(6)蒸餾裝置要保持良好的氣密性，防止漏氣，使用前用硫酸銨(99.9%)進行檢查 要求硫酸銨含氮量在21.19%+0.20%。

(7)消化爐的消解孔不能有空位置，可以用空白消化管加硫酸補位。

(8)定期檢查各消解孔溫度的均勻性，溫度偏低的孔會造成消解不完全，結(jié)果偏低?？捎酶骺紫鉁y定同一飼料，結(jié)果與平均結(jié)果的精密度超出國標(biāo)要求范圍的孔標(biāo)記不用。

(9)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度一般控制在0.1 mol/L±5%范圍內(nèi)(具體請參照GB/T601-2016化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》[3]);在滴定時，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度過低會消耗過多的滴定液，造成試劑浪費，濃度過高則消耗的滴定液過少，導(dǎo)致較大的系統(tǒng)誤差。配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液時。需要標(biāo)定后使用。

(10)混合指示液不可存放時間過長，否則乙醇揮發(fā)會導(dǎo)致指示終點顏魚發(fā)生變化，儲存時應(yīng)注意室溫避光、密封保存，有效期為 3 個月。經(jīng)驗表明，夏季 2 周、冬季 4周內(nèi)使用效果最佳。

(11)硼酸吸收液盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存時間不宜過長。全自動程序使用時室溫可保存1個月，否則硼酸氨分解揮發(fā)，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

(12)要保證蒸餾過程中的堿性環(huán)境，加堿要過量，一般是加入硫酸量的4倍。如在恭餾過程中加堿后消解液的顏色沒有變黑，要立即停止蒸餾，并補加氫氧化鈉溶液至消解液變黑。

(13)蒸餾過程中長時間使用高濃度氫氧化鈉溶液，管路內(nèi)部會形成固體結(jié)晶，造成管路堵塞從而減少加堿量。甚至無法加堿。因此應(yīng)定期將氫氧化鈉溶液換成溫蒸餾水對管路進行清洗。

(14)使用蔗糖代替樣品進行空白測定，空白試驗應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，如果滴定體積過大，應(yīng)檢查試劑質(zhì)量;

(15)通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控樣品來驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

除了上述的凱氏定氮法外，杜馬斯燃燒定氮法逐漸被推廣使用。杜馬斯燃燒定氨法是一種快速、低成本、自動化高的定氮方法[3,6]，能將樣品所含的有機氮和無機氮全部轉(zhuǎn)化成氮的氧化物后進行測定門，每個樣品僅需 4~6 min8]。但該法不能直接檢測液體樣品，且對樣品的粒度和均勻性都有嚴(yán)格要求，對于復(fù)雜樣品的分析效果欠佳具有一定的局限性6。有研究表明，杜馬斯定氮法測定植物性飼料原料中粗蛋白的結(jié)果比凱氏定氮法結(jié)果略高[3,9]。

2、飼料中粗灰分的測定

飼料中粗灰分的測定一般采用GB/T6438-2007 飼料中粗灰分的測定》[10]。

(1)應(yīng)注意馬弗爐的溫度不能過高或者過低，一般控制在(550+20)℃超過600℃會引起磷及硫等鹽的揮發(fā)[從而對檢測結(jié)果造成影響，并且在實驗過程中，儀器的使用溫度應(yīng)是設(shè)備的校準(zhǔn)溫度。同時，對設(shè)備的溫度進行校準(zhǔn)時，要對常用的溫度值進行校準(zhǔn)。

(2)做樣前，坩堝要先進行灼燒干燥，灼燒時間為馬弗爐溫度達到550℃后計時30min以上，干燥器中冷卻至室溫后稱重。

(3)炭化要完全:炭化時要注意通風(fēng)櫥對炭化過程中樣品的吸力，半蓋坩堝蓋，小火緩慢加熱至無黑煙產(chǎn)生:使用電爐炭化時坩堝要放在石棉網(wǎng)上，且電爐功率不能太大，防止燃燒過于劇烈造成損失，整個過程避免產(chǎn)生明火。

(4)灰化要完全:放入樣品前馬弗爐應(yīng)預(yù)先加熱達到550℃樣品灼燒3h后觀察是否有未灰化的黑色炭粒，若無，繼續(xù)灼燒 1 h，若有，待坩堝冷卻后，加水潤濕殘渣。烘干后繼續(xù)灼燒，直至灰化完全。

(5)灰化終點判斷:以時間加樣品的灰化狀態(tài)結(jié)合判斷，不可單純以時間來判定灰化終點，灰化終點應(yīng)為樣品殘灰呈現(xiàn)灰白色或淺灰色。要注意特殊樣品，如鐵含量高的樣品殘灰呈現(xiàn)褐色，錳、銅含量高的樣品，殘灰呈現(xiàn)藍綠色。

(6)灰化后，不可立刻從馬弗爐中取出坩堝或放置在常溫的臺面上，應(yīng)待溫度稍微下降后再取出樣品，否則易導(dǎo)致坩堝遇冷開裂。

(7)玉米蛋白粉、大米蛋白粉等樣品灰化后容易有黑色碳粒,需要加水烘干后再次灰化。

(8)一般飼料樣品先灰化3h，再灰化1h，即可達到恒重，但部分樣品(玉米蛋白粉、大米蛋白粉等)按照國標(biāo)規(guī)定的溫度和時間灰化不完全，應(yīng)適當(dāng)延長灰化時間，使樣品中的有機物完全氧化，減少實驗誤差[112]。

有研究表明，馬弗爐的預(yù)熱時間、預(yù)熱溫度和坩堝擺放方式的變化都會導(dǎo)致結(jié)果偏差[13]。

3、飼料中水分的測定

飼料中水分的測定一般采用GB/T6435-2014《飼料中水分的測定》[14]，分直接干燥法和減壓干燥法。使用該標(biāo)準(zhǔn)時，一定要注意該標(biāo)準(zhǔn)不適用的樣品類型，特別是玉米及其他谷物等。該標(biāo)準(zhǔn)中提到的GB/T21305-2007《谷物及谷物制品水分的測定 常規(guī)法》[15]已經(jīng)廢止。玉米水分按GB/T10362-2008《糧油檢驗玉米水分測定》[16]標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。但由于玉米的水分含量直接影響交易雙方的結(jié)算最好由交易雙方通過協(xié)議約定檢測方法。

3.1 直接干燥法

(1)烘干溫度:按國標(biāo)推薦溫度(103+2)℃執(zhí)行。

(2)樣品不可鋪的太厚或太薄，應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定“使樣品鋪開約0.3g/cm2”，根據(jù)經(jīng)驗厚度一般不超過0.5cm。

(3)樣品制備要選擇合適的粉碎設(shè)備，不可使用旋風(fēng)磨，粉碎全部通過1mm(18目)標(biāo)準(zhǔn)篩，經(jīng)四分法制得試樣放于樣品袋內(nèi)，密封。粉碎或研磨過程樣品暴露在空氣中的時間會影響檢測結(jié)果[17]。

(4)稱量皿使用時必須戴潔凈棉質(zhì)手套，在烘干過程中不要隨意打開烘箱門。

(5)稱量皿應(yīng)松散均勻的擺放在烘箱內(nèi)，平均每立方分米烘箱內(nèi)最多放一個，不可碰觸烘箱壁，樣品烘干時要打開器皿蓋，樣品從烘箱中取出時，應(yīng)戴棉質(zhì)手套從烘箱內(nèi)快速蓋上器皿蓋后再取出，立刻放人干燥器內(nèi)。

(6)應(yīng)注意干燥器內(nèi)干燥劑的顏色，一般使用變色硅膠，一日出現(xiàn)吸潮變色，應(yīng)立即放入烘箱內(nèi)烘干或者更換新的干燥劑。

(7)烘箱溫度設(shè)置要準(zhǔn)確，溫度要按照烘箱檢定(或校準(zhǔn))時給出的校準(zhǔn)溫度來設(shè)置，測樣前應(yīng)提前讓溫度升至檢測方法要求的溫度。同時要注意烘箱實際工作溫度的穩(wěn)定性[17]。烘箱烘干時間過長會導(dǎo)致過多的非水分損失，從而導(dǎo)致結(jié)果偏高[18]。

采樣時樣品的代表性、存儲條件會影響檢測結(jié)果的代表性[17]。一些含有揮發(fā)性成分的飼草和飼料樣品不適合直接干燥法[19]。

3.2 減壓干燥法

(1)適用于脂肪含量高、液體或半固體的樣品;

(2)溫度及真空達到設(shè)定條件時開始計時:

(3)脂肪含量較高的樣品，因高溫脂肪容易氧化，烘干時間過長反而會增重，應(yīng)以增重前的質(zhì)量為準(zhǔn)。
 

5. 飼料中鈣的測定

飼料中鈣的測定一般采用GB/T6436-2018《飼料中鈣的測定》[20]。

國標(biāo)中有兩種測定方法:高錳酸鉀法和乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法，這兩個方法均為滴定法。若是植物性飼料原料或其他鈣含量較低的樣品，可選用GB/T13885-2017《飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定原子吸收光譜法》1進行檢測，該方法檢出限為50mg/kg。測定時要根據(jù)樣品的類別、性質(zhì)選擇合適的前處理方式，濕法消解加入高氯酸后，嚴(yán)禁蒸干，通常也可和總磷測定共用一份處理液。

5.1高錳酸鉀法注意事項

(1)甲基紅指示劑應(yīng)定期配制，于棕色瓶中可儲存2個月左右;

(2)生成草酸鈣沉淀時應(yīng)注意:將試樣分解液于電爐上小心煮沸，向燒杯中慢慢滴加熱的草酸銨溶液(42 g/L)并不斷攪拌，如果溶液變?yōu)槌壬?，?yīng)補加鹽酸溶液(1:3,體積比)使其變?yōu)榧t色，再煮沸數(shù)分鐘，防止沉淀形成細小顆粒，草酸銨溶液應(yīng)提前加熱:

(3)室溫下放置過夜(12 h)或沸水浴加熱2 h使沉淀陳化;

(4)洗滌草酸鈣沉淀時，應(yīng)使用無灰的中速定量濾紙，必須沿濾紙邊緣向下洗，使沉淀集中于濾紙中心，以免損失。每次洗滌不得超過漏斗體積的2/3[22]，

(5)高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定時，最初 1~2 滴滴入變紅.紅色褪去速度較慢，不斷攪拌使溶液均勻，隨后可勻速滴定，邊滴邊攪拌，當(dāng)?shù)稳撕蠹t色面積越來越大時，即快到滴定終點，最后半滴滴人，搖勻后溶液呈粉紅色，30s不褪色，即到終點。配制高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液時，需要標(biāo)定后使用。

5.2 乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法注意事項

(1)要注意加人掩蔽劑的順序，每加一種試劑，均需充分混勻，若是順序出現(xiàn)差錯或未搖勻，建議重做:

(2)淀粉溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配;

(3)三乙醇胺本身黏度較大，配成50%(V/V)的溶液便于使用:乙二胺由于揮發(fā)性較強，也可配成50%(V/V的溶液使用[21;

(4)加入氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值到強堿性后應(yīng)立即進行滴定，防止鈣沉淀，一般此時的pH 值應(yīng)大于 12:

(5)應(yīng)在黑色背景下進行滴定，因鈣黃綠素指示劑不穩(wěn)定，一般用固體，指示劑加人量過多，會影響滴定終點顏色的判斷。

6. 飼料中總磷的測定

飼料中總磷的測定一般采用GB/T6437-2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》[23]。

(1)注意標(biāo)準(zhǔn)適用范圍，本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料原料及飼料產(chǎn)品，飼料添加劑要按照其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進行相關(guān)指標(biāo)的檢測，比如，飼料添加劑磷酸氫鈣中總磷含量測定應(yīng)按照其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)GB22549-2017《飼料添加劑磷酸氫鈣》[24]的規(guī)定執(zhí)行;

(2)磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液:制備好的磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液(50ug/mL)需置于聚乙烯瓶中4℃可儲存1個月:

(3)顯色劑:避光保存，放置時間不宜過久，使用前應(yīng)檢查是否有絮狀物和沉淀生成，若有則不能繼續(xù)使用;

(4)干灰化:國標(biāo)規(guī)定“炭化后，在550℃灼燒3 h(或測粗灰分繼續(xù)進行)”，對于稱樣量較大的情況，應(yīng)適當(dāng)延長灼燒時間，保證徹底灰化，同時需注意檢查坩堝是否炸裂;

(5)濕法消解時注意安全，加人高氯酸后應(yīng)防止蒸干;

(6)鹽酸溶解法適用于載體內(nèi)不含有機物的微量元素預(yù)混合飼料;

(7)分光光度計在使用時，吸光度一般在 0.2~0.8之間時誤差較小，低含量樣品應(yīng)加大稱樣量或增大移取體積。高含量樣品應(yīng)適當(dāng)進行稀釋，使樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi);

(8)不同類型樣品應(yīng)選擇相應(yīng)的前處理方式，每次測定時都應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。有人檢測總磷時不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一直沿用之前的回歸方程進行計算結(jié)果。

7.飼料中粗脂肪的測定

飼料中粗脂肪的測定一般采用GB/T6433-2006《飼料中粗脂肪的測定》[25]。

(1)注意國標(biāo)的適用范圍，先分B類再分A類，油籽和油籽殘渣不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。膨化膨脹類飼料原料及膨化類飼料產(chǎn)品，使用索氏直接抽提法測定粗脂肪結(jié)果嚴(yán)重偏低應(yīng)采用酸水解法[26。乳粉類產(chǎn)品使用索氏直接抽提法測定粗脂肪結(jié)果嚴(yán)重偏低，建議采用食品方法進行檢測[27].

(2)石油醚要使用沸點范圍40~60℃的，用脫脂棉覆蓋樣品易有顆粒流出，建議用濾紙包樣品。濾紙包的高度要低于提取器虹吸管的高度:

(3)注意回流的速度和時間，調(diào)節(jié)加熱裝置，使每小時至少回流10次一般樣品要求回流60次以上若回流次數(shù)達不到，可適當(dāng)延長回流時間或提高加熱溫度;

(4)抽提好的樣品放人烘箱干燥前，應(yīng)先在通風(fēng)櫥內(nèi)晾一會，揮發(fā)除去殘留的石油醚:

(5)如使用自動抽提儀或索氏抽提儀，以儀器的使用方法為參考，用質(zhì)控樣驗證儀器提取效果，并調(diào)節(jié)最佳蒸餾速度;

(6)可用無水乙醚代替石油醚進行抽提樣品:

(7)抽提過程嚴(yán)禁明火加熱，保持室內(nèi)良好的通風(fēng)[28]。最好在通風(fēng)柜中進行。

8、飼料中粗纖維的測定

飼料中粗纖維的測定一般采用 GB/T 6434-2006《飼料中粗纖維的含量測定 過濾法 》29，注意該方法的適用范圍粗纖維低于 10 g/kg的飼料樣品不能用此法進行檢測。

(1)樣品的粒度對結(jié)果的影響較大，一般要全部通過1 mm 標(biāo)準(zhǔn)篩，有研究表明，粒度越大，粗纖維含量越高[30]；

(2)控制樣品的稱樣量在 1g 左右，稱樣量太大時，酸堿洗滌不完全[31]；

(3)根據(jù)樣品的脂肪和碳酸鹽含量情況選擇合適的前處理方式:粗脂肪含量小于 10%、碳酸鹽含量小于 5%的樣品，不需要進行預(yù)處理。粗脂肪含量大于 10%的樣品，按規(guī)定方法進行預(yù)脫脂，否則消耗堿影響結(jié)果:碳酸鹽含量大于 5%的試樣，按照規(guī)定方法進行除碳酸鹽，否則消耗酸影響結(jié)果；

(4)氫氧化鉀溶液配制時，應(yīng)使用煮開后冷卻的蒸餾水，以除去水中的 CO2；

(5)硫酸溶液和氫氧化鉀溶液使用量較大，每次配制溶液體積要滿足測定樣品需要量；

(6)石油醚應(yīng)選用沸點范圍 40~60°C；

(7)酸堿消煮時，溶液易發(fā)生暴沸，溫度不可過高，為防止溶液迅速上冒，應(yīng)時刻觀察溶液沸騰狀態(tài)，保持微沸；

(8)沸騰期間保持體積不變，可在燒杯外壁溶液高度劃線標(biāo)記，通過補加冷的蒸餾水到標(biāo)線處，來保持液體酸堿濃度基本恒定；

(9)清洗殘渣時要用熱的蒸餾水，切記應(yīng)提前備好，否則會影響實驗進度；

(10)干燥前必須將丙酮揮發(fā)完全后再放入烘箱；

(11)灰化時注意事項同灰分測定。

除上述方法外，濾袋法測定粗纖維也越來越受關(guān)注該方法具有操作簡單、效率高、準(zhǔn)確度高等特點，并且部分樣品用國標(biāo)法和濾袋法測得粗纖維結(jié)果差異不顯著[30,32]

9、 飼料中水溶性氯化物的測定

飼料中水溶性氯化物的測定一般采用GB/T6439-2007《飼料中水溶性氯化物的測定》[33]。

(1)根據(jù)試樣是否含有機物，選擇對應(yīng)的試樣溶液制備方法；

(2)加入過量的硝酸銀溶液要劇烈振搖，使形成的氯化銀沉淀被充分包裹，減少氯化銀和硫氰酸銀的轉(zhuǎn)化，促使沉淀凝聚；

(3)控制滴定速度，終點顏色要仔細觀察，空白試驗應(yīng)和樣品同時進行；

(4)應(yīng)注意國標(biāo)中計算公杉啊箔啊傲式空白值不能是負值；

(5)本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)氯離子來計算氯化鈉含量的，由于飼料中添加其他原料可能帶入氯離子，通過此法測定的氯化鈉含量可能會有比實際添加量高的情況[22]；

(6)滴定時如不出現(xiàn)沉淀，且顏色褪去較快，建議棕紅色不褪色5s即記錄滴定體積，并采用GB/T 6439-92《飼料中水溶性氯化物的測定方法》34]中附錄A 的方法對結(jié)果進行驗證。

10、小結(jié)

飼料常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)的測定是粗略評定飼料營養(yǎng)價值的基本方法之一，也是進行飼料原料和產(chǎn)品質(zhì)量控制的基礎(chǔ)依據(jù)。把握好營養(yǎng)指標(biāo)配方含量高低，控制好飼料產(chǎn)品營養(yǎng)均衡，可節(jié)約企業(yè)的生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，從而增加經(jīng)濟效益。

實驗室在開展檢測前，一定要認真選擇現(xiàn)行有效的方法。在實際采用這些檢測方法時，一定要開展檢測方法的驗證或確認，不能采用未經(jīng)驗證或確認的檢測方法。

檢測過程中的細微操作差異，都可能導(dǎo)致結(jié)果偏差因此在檢測過程中應(yīng)注意每一個細微的環(huán)節(jié)，采取規(guī)范操和控制措施，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性非常重要。

在計算檢測結(jié)果時，要注意結(jié)果的保留位數(shù)。在對檢測結(jié)果進行合規(guī)性或符合性判定時，要結(jié)合該飼料原料或飼料產(chǎn)品的基本營養(yǎng)指標(biāo)的合理范圍。當(dāng)出現(xiàn)數(shù)據(jù)異?；虺龊侠矸秶鷷r，要找出檢測過程中可能出現(xiàn)的誤操作或不規(guī)范操作。

查找原因時不要忽視檢測過程的環(huán)境條件試劑材料等。當(dāng)檢測值在臨界值附近時、除多次重復(fù)檢測外，最好進行不確定度評定[35.36]。

日常檢測時，可以參考GB/T 27043-2012 常態(tài)化開展多種形式的實驗室間能力比對[37]。除上述化學(xué)方法檢測飼料常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)外，近紅外光譜法也被廣泛應(yīng)用[38-40]，但化學(xué)方法是建立近紅外定標(biāo)模型的重要基礎(chǔ)，這一點往往被忽略。

來源：食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報、畜牧人網(wǎng)站